苏氨酸$^{1,*,\triangle}$
$^{1}$ 苏格兰大学
$^{*}$ 苏氨酸@zhihu.com
$^{\triangle}$ 同等贡献

摘要

光纤测量法（fiber photometry）在神经科学在体研究中得到了广泛应用，然而其长期植入对脑组织结构完整性的影响尚未得到充分评估。本研究在使用光纤测量法记录小鼠双侧海马体神经元活动的实验时偶然发现：双侧dCA1各植入1-2根直径200 μm光纤探针、持续时长超过12周的小鼠，在灌注固定后的组织学检查中呈现出显著的海马体形态学变形，表现为背腹径压缩及整体结构扁平化。通过对照实验排除了切片方向偏差及颅外机械挤压等方法学混杂因素后，上述形态学改变仍稳定复现，且与单侧植入对照组之间存在明显的侧别差异。此结果验证了神经科学在体研究的一个普遍问题：植入探针、电极或透镜等设备可能对小鼠的大脑造成不可逆的改变。

关键词：海马体；光纤测量；电极；小鼠

1 引言

光纤测量（fiber photometry）是一种利用光来诱导和测量生物传感器构象变化引起荧光波动的光学技术[1]。具体而言，特定波长的激光通过光纤传输，激发荧光信号，该荧光通过同一光纤返回，经光电探测器等进行量化分析。

简而言之，就是实验者向小鼠脑内注射特定病毒，使目标神经元产生荧光，指示神经元活动。该方法可在自由活动动物体内实现对特定神经元群体活动的毫秒级时间分辨率记录，同时兼容EEG、EMG等多模态神经信号采集设备，且手术创伤相对较小，因此备受神经科学家们的喜爱。

然而，本实验在预期成果之外惊奇地发现了一个百思不得其解的现象：当双侧海马被植入2根以上电极，且持续时间近4个月时，小鼠的海马体可能会发生变形（被压扁了）。

2 研究方法

2.1 动物

实验采用C57BL/6JCrl小鼠（最普通的野生小鼠）。动物在12小时明暗交替的饲养环境中单笼饲养，全程自由摄取食物和饮水。所有实验操作均遵循实验动物护理与相关指南，并经某苏格兰大学伦理委员会审批通过。

2.2 手术/行为实验/组织成像

所有小鼠在单次手术中完成病毒载体注射与光纤探针植入。

1. 术前麻醉、固定、恒温、备皮及消毒等。沿颅骨正中线切开头皮以充分暴露颅骨，在背侧海马体上方行双侧颅骨开窗，去除脑膜，冲洗脑表面。
2. 将表达荧光指示蛋白的重组腺相关病毒（AAV）注射至海马背侧CA1区（dCA1）。
3. 左脑dorsal CA1植入2个直径200 μm的光纤，右脑dorsal CA1植入1个200 μm的光纤。手术结束后缝线缝合，术后24h内镇痛。
4. 行为学实验若干天。
5. 观察若干天。
6. 12-16周后进行脑组织取材及组织学验证。

3 结果与讨论

在未植入光纤的正常小鼠中，冠状切片上的dCA1呈现出符合C57BL/6解剖特征的典型弧形结构，CA1锥体细胞层排列致密规则，海马整体形态饱满，背腹径与内外径比例正常（图1）。

而此次双侧dCA1植入光纤探针且在体留存时长超过12周的2只小鼠中，竟然出现海马体结构扁平化。笔者真的百思不得其解，因为大部分实验小鼠都是基因型健康，没道理出现不明原因的大脑萎缩。所以逐步排查问题出现在哪。

可能问题1：切面水平偏斜。 若脑组织在包埋时未能水平固定，斜切面可能导致海马投影形态变形，出现视觉上的压扁假象。

解决1： 把图发到实验室群里询问大家：“这是什么情况！！”

结果1： 实验室一位经常做histology（组织学验证）的博士说：你可能脑子切歪了——就是切大脑的时候没有水平放置。

反思1： 这个原因其实非常可能，因为实验室最近换了新的freezing microtome，那个放脑组织的平台（小grid平面）似乎有些凹凸不平（疙里疙瘩的）。因此可能未平涂OCT以水平固定脑组织，以至于真的有可能把脑子放斜了！

但是，我也并没有证据来验证斜着切的脑组织是什么样子，只能用3D brain Atlas脑补一下，感觉可能切斜了海马体是会变小。

可能问题2：颅外机械挤压。 个人既往习惯于灌注后将含植入装置的完整头颅浸入含有PFA（多聚甲醛，即固定剂）的离心管中固定，这样光纤植入的部位会被固定得更好，在切片成像里面可以看到很清楚的光纤track。然而试管体积有限，当植入装置体积较大时，管壁可能会对组织侧向挤压造成颅内组织形变。

解决2： 为了排除上述实验步骤所导致的变形，我进行了2:2对照实验进行验证。2只双边植入的小鼠为实验组，2只单边植入的小鼠（还是littermate）为对照组。

结果2： 在上述两类混杂因素均经操作改进排除后（水平灌注，直接取材），双侧植入组小鼠（n = 2）的海马体形态学压扁现象仍稳定复现（图4），表明所观察到的形态学改变并非方法学假象，而是真实的组织学改变。

同批次单侧植入对照组小鼠（n = 2）在相同时长（>12周）后接受组织学检查。结果显示，植入侧（单根光纤）与对侧（未植入侧）海马形态均未见明显扁平化，整体结构与正常解剖形态高度一致（图5、图6）。该侧别对照结果进一步支持了海马体形态变形与双侧多根光纤长期植入之间存在关联的推断。

4 结论

小鼠海马体双边植入光纤，植入时间超过三个月，小鼠的海马体可能会被压扁。

此前关于光纤的研究混杂因素大都集中在荧光噪声控制、光漂白伪影校正及运动伪影剔除等方面，而本研究首次发现双侧植入光纤可能造成的宏观形态学改变，其机制和该变化所致的功能性改变尚未明确，仍需进一步研究。

部分网友认为这也是一种plasticity，部分网友认为这个研究对未来脑机接口的发展趋势将有重大影响，造成股价下跌。

声明

作者本来只想给小鼠海马体双边植入光纤采集信号，完成自己的博士论文，这个发现纯属serendipity。

作者做过很多单侧植入光纤的实验了，如果植入设备不放很久，比如小鼠做完实验马上取材（植入后1-2个月），histology出来的图还挺漂亮的。

致谢

小鼠们和实验室的同学们。

参考文献

[1] Simpson, E. H., Akam, T., Patriarchi, T., Blanco-Pozo, M., Burgeno, L. M., Mohebi, A., Cragg, S. J., & Walton, M. E. (2024). Lights, fiber, action! A primer on in vivo fiber photometry. Neuron, 112(5), 718-739. https://doi.org/10.1016/j.neuron.2023.11.016.