于人粪便滤液用于肠道菌群中难培养微生物培养的研究

Rubbish编辑部2026-04-012026-04-01

Songzi $^{1,*,\Delta}$ ，Yueyue $^{2,\Delta}$ ，David Wu $^{1}$
$^{1}$ 烟台科云精密机电研究院
$^{2}$ Keyun Precision Electromechanical (Yantai) Co., Ltd.
$^{*}$ 189144128@qq.com
$^{\Delta}$ 同等贡献

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摘要

传统培养依赖营养丰富的琼脂平板，这对快速生长的细菌有利，却抑制了生长缓慢的细菌。按物种数计，人体肠道中有约 60%-70% 的微生物不可培养。而粪便滤液提供了一种接近天然的生长基质，让微生物在更熟悉、压力更小的环境中生长。粪便滤液（以下简称“粪汤”）是通过离心和过滤去除细菌细胞、食物残渣和大颗粒后得到的，含有微生物代谢物产生的短链脂肪酸、胆汁酸以及宿主来源分子、难降解的植物多糖等，其pH值、渗透压和氧化还原电位等，都与肠道环境高度一致。粪汤被用于肠道菌群中难培养微生物的研究，模拟了微生物原始的天然生存环境，打破了传统培养方法的局限。

关键词：粪便；微生物培养；肠道微生物；生物医学

1 引言

人体肠道菌群在宿主的营养代谢、免疫调节及抵御病原体等方面发挥着至关重要的作用。近年来，随着宏基因组学等不依赖于培养技术的飞速发展，研究人员对肠道菌群的物种组成、基因功能及其与多种疾病（如炎症性肠病、肥胖、糖尿病等）的关联有了前所未有的认识。然而，这些分子生物学技术主要揭示了菌群的结构与功能潜力，而要深入探究特定微生物的生理特性、代谢机制及其与宿主的互作关系，最终仍需回归到微生物的分离与纯培养。

尽管目前从人类粪便中已能分离培养出数百种微生物，但肠道环境中的绝大多数物种仍被视为“难培养”或“尚未培养”的微生物。这种可培养性低下的困境，主要源于传统实验室培养基与肠道原生环境之间的巨大差异。肠道是一个高度复杂且动态变化的微生态系统，其中充满了宿主来源的分子（如黏蛋白、激素）、膳食成分及其微生物代谢产物（如短链脂肪酸、维生素、次级胆汁酸）。这些因子共同构成了微生物生长的天然“信号网络”和营养基础，而常规的人工合成培养基往往成分简单，缺乏这些关键的生长因子、信号分子以及微生物间互作所依赖的生态位条件。

为突破这一瓶颈，有了尝试模拟肠道微环境的研究，粪汤养菌相较各种成本高昂的生物芯片和微流控技术大大降低了成本。粪便滤液富含来源于宿主和菌群本身的多种可溶性因子，如未消化的膳食纤维、微生物胞外产物、群体感应信号分子以及各种代谢物，能够最大程度地还原肠道微生物的原生化学环境。将其作为培养基添加剂或基础培养液，旨在恢复部分难培养微生物在体外生长所需的特定条件，唤醒其“不可培养”状态。该方法已在近年来的一系列研究中被证实能够显著提高肠道微生物的分离效率，拓展人类肠道“可培养”物种的资源。

开展关于人粪便滤液在肠道菌群中难培养微生物培养的研究，不仅有助于深入理解微生物的生存需求与互作网络，更能为基础微生物学研究和临床转化（如益生菌开发、粪菌移植机制解析）提供宝贵的菌株资源和理论依据。

2 研究材料与方法

本节介绍研究材料方法和实验过程。

2.1 实验材料

一次性塑料培养皿若干，供应商不明；
玻璃防水胶、矿泉水瓶（宝特瓶）若干；
铁丝曲的接种环；
食品果冻用琼脂、食用土豆淀粉、食品用白砂糖；
一次性无菌注射器若干；
厌氧工作站（鱼缸改造）；
UV-C紫外灯。

本次实验所用人类粪便取自旱厕，纯化水为娃哈哈瓶装水。

2.2 实验过程

本次实验使用添加粪汤的粪便滤液琼脂与不含粪汤成分的固体培养基按相同参数稀释涂布相同的人类浸出物上清液并在相同环境下培养相同时间，通过计数平板上菌落数初步判定其能培养的微生物种群数。

2.2.1 粪便滤液琼脂（以下简称屎琼脂）的配制

取新鲜人类粪便 15g，纯化水 100mL，装入洁净的矿泉水瓶中，手动震荡 1min，静置沉降 12h，取上清，紫外辐照灭菌12h，制成粪汤备用。

取食品用白砂糖、食用淀粉、琼脂各适量配制成培养基干粉，加入适量纯化水，实验组加入占总重 10% 的粪汤，对照组用等质量纯化水代替。高温灭菌后在厌氧工作站中倒平板，冷却 2h 备用。

用制备此“类YPD培养基”的相同工艺，以各种厨余垃圾和日化品为原料，制备出“类LB培养基”“类MLB培养基”进行对照实验，每组各 4 对 90x15mm平皿。

2.2.2 粪便细菌悬液的制备与接种

取新鲜人类粪便 15g，纯化水15mL，装入宝特瓶手动震荡摇匀 15s，静置沉降 1h，在厌氧工作站中用一次性注射器各取上清 1mL 分别涂布于每一个实验组和对照组平板，盖盖子并用玻璃胶密封，30℃倒置培养 24h。

3 结果与讨论

实验结果见下表：

表1. 实验结果

组别	平均活菌数（CFU/mL）
材料	实验组
类YPD培养基	100～120
类LB培养基	800～1000
类MLB培养基	800～1100

根据结果可以看出，屎琼脂相较于不含粪汤的类YPD培养基，有极大可能能培养更多的微生物种群。然而，由于实验设计不足和客观因素限制，结果难以排除用作添加剂的粪汤本身携带的微生物影响实验结果造成的误差，从图中也可以看出目测误差之大。尽管如此，本实验依然具有一定的参考意义。

4 结论

综上所述，人类粪便滤液作为一种接近肠道原生环境的复杂培养基质，为突破肠道难培养微生物的培养瓶颈提供了有效手段。本研究证实，粪便滤液通过提供天然的生长因子、信号分子及维持微生物间互作的生态条件，显著提升了肠道微生物的体外可培养率，并成功分离到一批在传统培养基中无法生长的菌株。

这一方法不仅丰富了人类肠道微生物的资源库，为解析肠道暗物质的功能提供了实体材料，也验证了“模拟原生境”在微生物培养策略中的关键作用。然而，粪便滤液成分的复杂性与异质性仍是其标准化应用的挑战。未来研究需结合代谢组学分析，解析其关键促生长因子，并探索将有效成分简化、重组至人工培养基中，以实现从经验模拟向理性设计的转化。总体而言，基于粪便滤液的培养策略是连接肠道微生物宏基因组信息与纯培养资源的重要桥梁，对深入理解肠道微生态及开发微生态制品具有深远意义。